PGS Ho Ba Do

BÁO CÁO KHOA HỌC

Đề tài: “Nghiên cứu phát triển nguồn nguyên liệu và sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh ung thư từ cây thuốc Bán chi liên (Scutellaria barbata), Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) và nấm Linh chi (Ganoderma lucidus) tại Lào Cai và vùng Tây Bắc”

PGS.TS Hồ Bá Do
Nguyên Giảng viên cao cấp Học viện Quân y
Viện trưởng Viện nghiên cứu phát triển Y Dược cổ truyền Việt Nam
Phó Chủ tịch Hội Nam y Việt Nam

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết

Việt Nam là một quốc gia sở hữu nguồn tài nguyên cây thuốc và tri thức sử dụng cây thuốc vô cùng phong phú, đa dạng và là một thị trường tiêu thụ dược liệu và các sản phẩm dược liệu rất lớn. Mặc dù với nguồn dược liệu tiềm năng như vậy nhưng dược liệu trên thị trường hiện nay chủ yếu là nhập khẩu từ Trung Quốc.

Chất lượng dược liệu trên thị trường chưa được đồng đều, ổn định và an toàn. Cần phải có những chiến lược và kế hoạch cụ thể để khai thác tiềm năng về nguồn tài nguyên dược liệu phục vụ phát triển kinh tế – xã hội và chăm sóc sức khỏe nhân dân.

Vùng Tây Bắc nước ta là vùng có đất đai tương đối rộng lớn, có điều kiện tự nhiên thuận lợi tạo nên nguồn tài nguyên cây thuốc rất phong phú và đa dạng, có nhiều loài cây thuốc bản địa có giá trị sử dụng và kinh tế cao.

Việc phát triển trồng cây dược liệu tại đây sẽ giúp cung cấp dược liệu đạt chuẩn phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe nhân dân địa phương và trong nước, tạo nguồn dược liệu chuẩn hệ thống công nghiệp dược hiện đại, cho xuất khẩu; giúp hình thành các mô hình sinh kế mới nhằm tăng thu nhập cho nhân dân Tây Bắc; giúp tăng liên thông, liên kết, trao đổi, lưu thông giữa các vùng miền, tạo sản phẩm đặc hữu gắn liền với du lịch địa phương.
Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ người mắc bệnh và tử vong do ung thư cao. Xu thế hiện nay thường ưu tiên sử dụng các sản phẩm từ tự nhiên, đặc biệt là những sản phẩm có nguồn gốc dược liệu. Trong số các dược liệu có tác dụng tốt trên bệnh ung thư, nổi bật có Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh.

Hiện nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu hiện đại chứng minh về tác dụng trên các bệnh ung thư của ba dược liệu này. Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo được đánh giá là có những điều kiện sinh trưởng và phát triển phù hợp tại một số tỉnh thuộc vùng Tây Bắc Việt Nam.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện triển khai đề tài “Nghiên cứu phát triển nguồn nguyên liệu và sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh ung thư từ cây thuốc Bán chi liên (Scutellaria barbata), Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) và nấm Linh chi (Ganoderma lucidus) tại Lào Cai và vùng Tây Bắc”.

2. Mục tiêu đề tài

Xây dựng được vùng trồng để cung cấp nguyên liệu Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo có chất lượng tại vùng Tây Bắc.
Phát triển được 01 sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh ung thư từ ba cây thuốc Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi được cấp phép của Cục An toàn thực phẩm, Bộ Y tế.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.Bệnh ung thư
Khi bị kích thích bởi các tác nhân gây ung thư, các tế bào tăng sinh không tuân theo các cơ chế kiểm soát của cơ thể. Các tế bào ác tính có khả năng di căn tới các hạch bạch huyết, các tạng xa hình thành khối u thứ phát [1] [2].
Các phương pháp điều trị ung thư hiện nay là: Phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, điều trị nội tiết, điều trị miễn dịch, điều trị bằng phương pháp thiên nhiên… [1] [2].
Với xu hướng điều trị ung thư bằng liệu pháp tự nhiên thì việc nghiên cứu tạo chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư từ Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo, nấm Linh chi… sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

1.2. Các nghiên cứu về dược liệu Bán chi liên (Scutellaria barbata D. Don), Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.) và nấm Linh chi (Ganoderma lucidus (Leyss ex. Fr.) Karst)

1.2.1.Cây Bán chi liên

Tên khoa học: Scutellaria barbata D. Don; Tên đồng nghĩa: Scutellaria rivularis Wall. Họ: Bạc hà (Lamiaceae). [7] [8]
Bộ phận dùng: Toàn cây, dùng tươi hay phơi khô. [7] [8]
Thành phần hóa học và tác dụng dược lý:
Hiện nay đã phân lập được 131 hợp chất từ các loài Bán liên chi, bao gồm các flavonoid, alkaloid, diterpen, triterpenoid, polysaccharid, tinh dầu và một số hợp chất khác. Hàm lượng các thành phần hóa học được chiết xuất từ bán chi liên có sự thay đổi đáng kể phụ thuộc vào điều kiện trồng trọt, thời vụ thu hoạch. Do vậy, các tác dụng dược lý cũng có thể có sự thay đổi. Bán chi liên có chứa 49 hợp chất flavonoid và các dẫn xuất, bao gồm các flavone, flavonoid glycoside, flavanone và chalcone.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các tác dụng dược lý của các hợp chất này. Trong đó, đáng lưu ý nhất là tác dụng trên bệnh ung thư của hợp chất scutellarin thuộc nhóm flavone, một loại hợp chất hóa học phenolic. Ngoài ra, scutellarin còn có những tác dụng khác như kháng khuẩn, chống viêm, bảo vệ cơ tim, cải thiện chức năng thần kinh, tăng cường miễn dịch [3] [4] [5] [6].

1.2.2.Bạch hoa xà thiệt thảo

Tên khoa học: Hedyotis diffusa Willd.). Họ Cà phê: Rubiaceae. [7] [9]
Bộ phận dùng: Toàn cây, thu hái vào cuối mùa hạ, mùa thu. Rửa sạch rồi phơi hoặc sấy khô. [7] [9]
Nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý:
Cho đến nay, đã có 171 hợp chất được báo cáo có mặt trong Bạch hoa xà thiệt thảo, bao gồm các iridoid, triterpene, flavonoid, anthraquinone, phenolic acid và dẫn xuất, sterol, alkaloid, dầu dễ bay hơi, polysaccharide, cyclotide, và coumarin.
Các nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý của dược liệu này như tác dụng chống ung thư, tác dụng điều hòa miễn dịch, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ thần kinh và tác dụng chống viêm. [10]

1.2.3.Nấm Linh chi

Tên khoa học: Ganoderma lucidum (W. Curtis ex Fr.) P. Karst. [11] [12]
Họ nấm Lim (Ganodermataceae). [11] [12]
Thành phần hóa học: [13] [14]
Triterpenoid: Có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol được phân lập từ phân đoạn chiết không phân cực của nấm Linh chi.
Polysaccharid: Hiện nay, có hơn 200 polysaccharid đã được phân lập từ bào tử, quả thể và sợi của nấm Linh chi.
Peptid, protein, acid béo, acid amin, nucleotid, vitamin.
Kali, magnesi, calci, natri, sắt, kẽm, mangan, đồng, selenium, germanium.
Tác dụng dược lý: [11] [12]
Linh chi (G. lucidum (Leyss ex. Fr.) Karst) có các công dụng đáng lưu ý sau:
– Tác dụng chống ung thư: Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã chứng minh nấm Linh chi có khả năng ức chế phát triển của tế bào khối u.
– Bảo vệ gan, thận.
– Tác dụng chống oxy hóa và điều hòa miễn dịch.
Ngoài ra, theo các nghiên cứu nấm Linh chi còn có tác dụng cải thiện trí nhớ, bảo vệ tủy sống, tác dụng hạ đường huyết, cân bằng vi sinh vật đường ruột, chống viêm, cải thiện tổn thương da [11] [12].

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật trồng Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

2.1.1.Nghiên cứu thẩm định 02 dược liệu thu mua trong tự nhiên

Xử lý mẫu, làm tiêu bản cây trong phòng thí nghiệm: theo phương pháp của Diane Bridson & Leonard Forman.Mô tả hình thái: Mô tả hình thái các cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản theo pháp hình thái so sánh của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007).
Cắt giải phẫu: Theo phương pháp cải tiến của Trần Công Khánh (1981) và Nguyễn Nghĩa Thìn (2007).
Phân tích mẫu: Theo nguyên tắc phân tích từ tổng thể bên ngoài đến các chi tiết bên trong, phân tích từ cái lớn đến cái nhỏ. Ghi chép, sử dụng máy ảnh và kính hiển vi soi nổi để lưu lại hình ảnh chi tiết các bộ phận của mẫu.
Thẩm định tên khoa học: Sử dụng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu với khóa phân loại và bản mô tả trong Thực vật chí Trung Quốc – Flora of China (2005).

2.1.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật trồng Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

Đánh giá chất lượng mẫu đất, nước tại địa điểm trồng theo tiêu chí GACP.
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ trồng, mật độ khoảng cách trồng, chế độ phân bón, thời điểm, phương pháp thu hoạch đến sinh trưởng và năng suất dược liệu; Đánh giá thành phần và mức độ phổ biến sâu, bệnh hại.
Tiến hành thí nghiệm một nhân tố với các công thức khác nhau và được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), ba lần nhắc lại. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 10m2.
Các chỉ tiêu theo dõi: Thời gian sinh trưởng và phát triển; đánh giá sâu, bệnh hại; đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất dược liệu, Đánh giá chất lượng dược liệu.

2.2. Xây dựng mô hình trồng Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

2.2.1. Đánh giá chất lượng đất, nước tại một số địa điểm thuộc huyện Si Ma Cai và huyện Bắc Hà- Lào Cai để xác định vùng trồng

Đánh giá chất lượng đất, nước. Trên cơ sở kết quả phân tích đất, nước, điều khiện khí hậu tại vùng khảo sát, lựa chọn vùng trồng thích hợp để triển khai các mô hình trồng Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo.

2.2.2.Triển khai mô hình sản xuất dược liệu Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO quy mô 2ha

Áp dụng quy trình trồng Bán chi liên và quy trình trồng Bạch hoa xà thiệt thảo theo đã xây dựng được, tiến hành xây dựng mô hình trồng Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO quy mô 2ha/loại
Đánh giá chất lượng dược liệu trong mô hình.
Đánh giá về hiệu quả của mô hình: Hiệu quả về môi trường, kinh tế và xã hội.
Đánh giá nội bộ (hồ sơ quản lý) và theo danh mục GAPC –WHO.

2.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sơ chế, chế biến dược liệu Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp làm khô, bảo quản đến chất lượng dược liệu Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo. Mỗi yếu tố đều khảo sát ở quy mô 5kg dược liệu tươi/mẻ với 3 lần nhắc lại.
Các chỉ tiêu theo dõi, đánh giá: Tỷ lệ dược liệu tươi/khô; cảm quan, thời gian làm khô, tỷ lệ hư hỏng, độ ẩm, tro toàn phần, tỷ lệ vụn nát, hàm lượng scutellarin trong Bán chi liên và hàm lượng acid ursolic trong Bạch hoa xà thiệt thảo.

2.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho 03 dược liệu Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho các dược liệu với các chỉ tiêu: Mô tả, vi phẫu, bột, độ ẩm; tro toàn phần, tro không tan trong acid, tỷ lệ vụn nát, kim loại nặng, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, chất chiết được trong dược liệu, định tính bằng sắc ký lớp mỏng: Tùy từng loại dược liệu mà lựa chọn chỉ tiêu và áp dụng theo các phụ lục tương ứng với từng chỉ tiêu trong DĐVN V. Định lượng hoạt chất trong dược liệu nghiên cứu bằng HPLC, quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến.

2.5. Nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế 03 cao định chuẩn Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo, và nấm Linh chi

2.5.1.Phương pháp xác định lớp chất có tác dụng sinh học trong từng dược liệu

Chiết phân đoạn các dược liệu nghiên cứu trong các dung môi có độ phân cực khác nhau. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro đối với từng phân đoạn cắn khô của các dược liệu. Phân đoạn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh nhất sẽ được xác định nhóm hợp chất chính (flavonoid, triterpenoid, steroid) thông qua các phản ứng hóa học và phân tích HPLC để xác định được chất đánh dấu trong từng phân nhóm chính của từng dược liệu.

2.5.2.Nghiên cứu phương pháp định lượng chất đánh dấu trong các dược liệu

Định lượng scutellarin trong Bán chi liên, acid oleanolic trong Bạch hoa xà thiệt thảo, acid ganoderic A trong nấm Linh chi bằng phương pháp HPLC.
Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu: Chiết hồi lưu, dung môi chiết: ethanol.
Phương pháp bào chế bột cao khô dược liệu: Dịch chiết thu được sau khi chiết được cô đến cao lỏng (hàm ẩm khoảng 18-25%), trộn thêm tinh bột, sau đó trải đều ra khay, sấy khô rồi đem xay mịn bằng máy xay dược liệu.

2.5.3.Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của 03 loại cao định chuẩn Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi

Phương pháp đánh giá chất lượng của các bột cao khô dựa trên các chỉ tiêu:
+ Đánh giá tính chất bột bằng cảm quan; xác định độ ẩm theo phương pháp mất khối lượng do làm khô; xác định độ mịn (DĐVN);
+ Định tính bằng các phản ứng hóa học và/hoặc sắc ký lớp mỏng;
+ Tro toàn phần theo phương pháp TCVN 8124:2009;
+ Giới hạn nhiễm khuẩn theo các TCVN;
+ Hàm lượng kim loại nặng theo phương pháp AOAC 999.11.
+ Định lượng hàm lượng biomarker trong các bột cao khô (HPLC).
Phương pháp xây dựng TCCS bột cao khô: Trên cơ sở đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng, đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của bột cao khô.

2.6. Nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng Anti-U200

2.6.1.Nghiên cứu khảo sát tỷ lệ phối hợp 3 loại cao định chuẩn Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi trong công thức bào chế

Xây dựng 03 công thức phối trộn các bột cao khô Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi với các tỷ lệ khác nhau.
Sàng lọc tác dụng chống ung thư trên in vitro và đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm của 03 hỗn hợp bột.

2.6.2.Phương pháp xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng Anti – U200

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng biomarker trong hỗn hợp 03 bột cao khô Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi theo bằng HPLC-DAD hướng biomarker trong hỗn hợp 03 bột cao khô dẫn của ICH.

Xây dựng công thức viên nang cứng Anti – U200 thông qua:
– Xác định đặc tính lý hóa của nguyên liệu đầu vào;
– Thực hiện thí nghiệm sàng lọc tá dược;
– Khảo sát sự ảnh hưởng của tá dược dính sử dụng bào chế viên;
Các chỉ tiêu đánh giá: cảm quan về khả năng tạo hạt, độ ẩm, phân bố kích thước hạt, khối lượng viên, độ rã.
Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của sản phẩm viên nang cứng Anti-U200
Đánh giá chất lượng viên nang cứng Anti-U200 trên các chỉ tiêu:
– Đánh giá tính chất bằng cảm quan; xác định độ ẩm theo phương pháp mất khối lượng do làm khô; độ mịn; độ rã theo phương pháp thử độ rã viên nén và viên nang;
– Định tính Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo, nấm Linh chi sắc ký lớp mỏng;
– Tro không tan trong acid HCl theo phương pháp H. HD. QT. 001 của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia;
– Giới hạn nhiễm khuẩn theo các TCVN;
– Hàm lượng kim loại nặng theo phương pháp H. HD. QT. 429 (ICP-MS) của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
– Định lượng hàm lượng hoạt chất trong viên nang cứng Anti-U200 bẳng phương pháp HPLC (scutellarin và acid ganoderic A).
Trên cơ sở đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng, đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của viên nang cứng Anti-U200.
Nghiên cứu độ ổn định của viên nang cứng Anti-U200 trong điều kiện lão hóa cấp tốc (Nhiệt độ: 40oC ± 2 oC; độ ẩm: 75% ± 5%) và điều kiện dài hạn (Nhiệt độ: 30oC ± 2 oC; độ ẩm: 75% ± 5%) trong thời gian 0, 3 tháng.

2.7. Đánh giá tính an toàn và tính hiệu quả trên thực nghiệm của sản phẩm viên nang cứng Anti-U200

2.7.1. Đánh giá tính an toàn của sản phẩm Anti-U200

Nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm trên chuột nhắt trắng chủng Swiss được tiến hành theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon.
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của Anti-U200 (AU200) trên chuột cống trắng chủng Wistar được tiến hành theo Hướng dẫn của WHO.

2.7.2. Đánh giá tính hiệu quả của sản phẩm Anti-U200

Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên chuột nhắt trắng chủng Swiss bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid.
Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa được đánh giá trên mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol.
Nghiên cứu tác dụng chống ung thư: Áp dụng mô hình gây ung thư bằng hóa chất trên chuột nhắt bằng cách cho chuột uống DMBA.

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

3.1.Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật trồng Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

3.1.1.Kết quả thẩm định 02 dược liệu thu mua trong tự nhiên

Dựa vào quan sát các đặc điểm hình thái, tham khảo tài liệu khoa học về phân loại thực vật đáng tin cậy và kết quả giám định của các mẫu do TS. Nguyễn Thị Kim Thanh (Khoa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN và Công ty TNHH Khoa học tự nhiên) thực hiện đã xác định được tên khoa học các mẫu như sau:
Yêu cầu Kết quả 02 mẫu Lâm 21052018-01 và Lâm 21052018 – 02 Kết quả 02 mẫu Nga 14062018 – 01 và Nga 14062018 – 02
Tên khoa học: Scutellaria barbata D. Don Hedyotis diffusa Willd.
Synonym: Scutellaria rivularis Wall.Oldenlandia diffusa Roxb.
Tên Việt Nam: Bán chi liên, Hoàng cầm râu, Thẩm râu Bạch hoa xà thiệt thảo, Cỏ lưỡi rắn hoa trắng
Họ thực vật:Họ Hoa môi – Lamiaceae Họ Cà phê – Rubiaceae

3.1.2.Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật trồng Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

Các mẫu đất, nước đều đều đạt so với với QCVN.
Đã xây dựng được 01 quy trình kỹ thuật trồng Bán chi liên theo hướng GACP-WHO với kết quả nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng như sau:
– Thời vụ trồng thích hợp nhất cho cây Bán chi liên vào 20/2.
– Khoảng cách thích hợp nhất là 20 cm x 20 cm (Mật độ: 250.000 cây/ha
– Mức độ phổ biến của sâu, bệnh hại không đáng kể, không phải dùng thuốc xử lý.
– Thời điểm thích hợp nhất để thu hoạch là khi cây nở hoa rộ > 60%.
– Phương pháp thu hoạch thích hợp nhất là cắt cách gốc 3cm.
– Không phát hiện tồn dư kim loại nặng và thuốc bảo vệ thực vật trong dược liệu:
Đã xây dựng được 01 quy trình kỹ thuật trồng Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP-WHO với kết quả nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng như sau:
– Thời vụ trồng thích hợp nhất cho cây Bạch hoa xà thiệt thảo vào khoảng 01/03.
– Khoảng cách thích hợp nhất là 20 cm x 30 cm (Mật độ: 166.666 cây/ha).
– Công thức phân bón thích hợp nhất là 15.000 kg PC + 220 kg N + 110 kg P2O5 + 82,5 kg K2O/ha.
– Thời điểm thích hợp nhất để thu hoạch là khi cây nở hoa rộ > 60%.
– Phương pháp thu hoạch thích hợp nhất là cắt cách gốc 3cm.
– Không phát hiện tồn dư kim loại nặng và thuốc bảo vệ thực vật trong dược liệu:

3.2. Kết quả xây dựng mô hình trồng Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

3.2.1. Kết quả xây dựng mô hình trồng Bán chi liên theo hướng GACP – WHO

Hai địa điểm Bắc Hà và Si Ma Cai có chất lượng đất và nước hoàn toàn phù hợp để trồng bán chi liên theo hướng GACP-WHO.

Áp dụng quy trình trồng đã xây dựng được, đề tài đã triển khai xây dựng được mô hình trồng Bán chi liên với tổng diện tịch 02 ha tại xã Quan Thần Sán – Si Ma Cai và xã Lùng Phình – huyện Bắc Hà – tỉnh Lào Cai.
Các chỉ tiêu sinh trưởng về chiều cao, số nhánh và đường kính tán cho thấy cây bán chi liên sinh trưởng tốt. Địa điểm Bắc Hà cây tốt hơn chút ít so với điểm ở Si Ma Cai, năng suất thực thu tại Bắc Hà đạt 10,10 tấn/ha/năm, ở Si Ma Cai là 9,25 tấn/ha/năm. Các mẫu dược liệu bán chi liên đạt theo yêu cầu của DĐVN V.
Không tồn dư thuốc diệt cỏ, phân bón hóa học trong đất và ảnh hưởng đến môi trường xung quanh. Quá trình sản xuất đã tạo ra dược liệu bán chi liên sạch, góp phần tạo ra sản phẩm an toàn cho xã hội. Lãi ròng của cây bán chi liên cao tới 188,97 triệu đồng/ha.

3.2.2. Kết quả xây dựng mô hình trồng Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

Xã Phong Hải, huyện Bảo Thắng – Lào Cai có chất lượng đất và nước hoàn toàn phù hợp để trồng Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP-WHO.
Áp dụng quy trình trồng đã xây dựng được, đề tài đã triển khai xây dựng được mô hình trồng Bạch hoa xà thiệt thảo với tổng diện tích 02 ha tại xã Phong Hải – huyện Bảo Thắng – tỉnh Lào Cai.
Các chỉ tiêu sinh trưởng về chiều cao, số nhánh và đường kính tán cho thấy cây bán chi liên sinh trưởng tốt. Năng suất thực thu đạt

2,77 tấn/ha. Các mẫu dược liệu đều đạt theo yêu cầu của DĐVN V.
Không tồn dư thuốc diệt cỏ, phân bón hóa học trong đất và ảnh hưởng đến môi trường xung quanh. Quá trình sản xuất đã tạo ra dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo sạch, góp phần tạo ra sản phẩm an toàn cho xã hội. Lãi ròng của cây Bạch hoa xà thiệt thảo cao tới 75,94 triệu đồng/ha.

3.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình sơ chế, chế biến dược liệu Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO

-Về nước rửa: Yêu cầu nước rửa phải đạt tiêu chuẩn theo QCVN 02:2009/BYT – Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về chất lượng nước sinh hoạt.
– Về việc sơ chế dược liệu: Dược liệu tươi được rửa sạch đất cát, loại bỏ tạp chất. Sau khi rửa được rải lên các giàn thoáng để cho khô nước. Cắt dược liệu thành từng đoạn 3-4cm và tiến hành làm khô.
– Về ảnh hưởng của phương pháp phơi sấy: Phương pháp làm khô thích hợp nhất là sấy nhiệt. Nhiệt độ sấy ban đầu khoảng 50oC sau đó nâng dần lên 60oC đến khô đến độ ẩm ≤ 12%. Có thể sử dụng phương pháp phơi nếu thời tiết nắng ổn định.
– Về ảnh hưởng của biện pháp bảo quản: Bảo quản trong kho lạnh, đựng trong túi PE hoặc Bảo quản trong kho lạnh, đựng trong túi PE hút chân không. Nếu không có kho lạnh có thể duy trì nhiệt độ trong kho bảo quản ở khoảng 27oC.
– Về kết quả đánh giá chất lượng dược liệu sau sơ chế.
+ Bán chi liên: Đạt các chỉ tiêu trong DĐVN V. Hàm lượng scutellarin từ 0,65 % – 0,72 %.
+ Bạch hoa xà thiệt thảo: Đạt các chỉ tiêu DĐVN V. Hàm lượng (%) acid ursolic trong các mẫu bạch hoa xà thiệt thảo từ 0,15 % – 0,17 %, hàm lượng (%) acid oleanolic từ 0,027 % – 0,030 %.

3.4. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho 03 dược liệu Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi

3.4.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Bán chi liên

Các chỉ tiêu giữ nguyên trong DĐVN V về yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử bao gồm: Mô tả, vi phẫu, bột; độ ẩm (không quá 11,0%); tro toàn phần (không quá 10,0%); tro không tan trong acid (không quá 3,5%); tạp chất (không quá 2%); chất chiết được trong ethanol 70% (không thấp hơn 26% tính theo mẫu khô kiệt, phương pháp chiết nóng).
Các chỉ tiêu bổ sung, thay đổi bao gồm:
– Bổ sung chỉ tiêu về dư lượng kim loại nặng (As, Pb, Cd, Hg): Yêu cầu: không quá 5 phần triệu Pb; 1 phần triệu Cd; 0,2 phần triệu Hg, 2 phần triệu As.
– Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Benzen hexaclorid: Không quá 0,2 phần triệu.
– Chỉ tiêu định tính: Bổ sung thêm chất đối chiếu Apigenin so với DĐVN V.
– Chỉ tiêu định lượng: Chỉ tiêu định lượng scutellarin (HPLC) qui định hàm lượng ≥ 0,4 % (DĐVN qui định ≥ 0,2 %).
– Hàm lượng flavon tổng số theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến: qui định trong TCCS ≥ 4,0% (DĐVN qui định ≥ 1,5%).

3.4.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Bạch hoa xà thiệt thảo

Các chỉ tiêu giữ nguyên trong DĐVN V về yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử bao gồm: Mô tả; độ ẩm (không quá 13,0%), tro toàn phần (không quá 13,0%), tạp chất (Không quá 2%), chất chiết được trong ethanol 96% (không thấp hơn 8% tính theo dược liệu khô kiệt).
Các chỉ tiêu thay đổi, bổ sung:
– Bổ sung chỉ tiêu 04 kim loại nặng (As, Pb, Cd, Hg): Không quá 5 phần triệu Pb; 1 phần triệu Cd; 0,2 phần triệu Hg, 2 phần triệu As.
– Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Benzen hexaclorid: Không quá 0,2 phần triệu.
– Bổ sung chỉ tiêu định lượng acid ursolic và acid oleanolic bằng HPLC.

3.4.3. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nấm Linh chi

Các chỉ tiêu giữ nguyên trong DĐVN V về yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử bao gồm: Mô tả, bột, độ ẩm (không quá 17,0 %), tro toàn phần (không quá 3,0 %), tro không tan trong acid (không quá 5,0 %), chất chiết được trong ethanol 95 % (không thấp hơn 3% tính theo dược liệu khô kiệt).
Các chỉ tiêu thay đổi, bổ sung:
– Bổ sung chỉ tiêu 04 kim loại nặng (As, Pb, Cd, Hg): Không quá 5 phần triệu Pb; 1 phần triệu Cd; 0,2 phần triệu Hg, 2 phần triệu As.
– Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Benzen hexaclorid: Không quá 0,2 phần triệu.
– Chỉ tiêu định lượng acid ganoderic A (HPLC) qui định hàm lượng ≥ 0,02 %.
– Định lượng hàm lượng polysaccharid tổng số tính theo glucose (C6H12 O6) trong mẫu linh chi khô kiệt không thấp hơn 0,5 %.

3.5. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế 03 cao định chuẩn Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo, và nấm Linh chi

3.5.1. Kết quả xác định lớp chất có tác dụng sinh học trong từng dược liệu

Chiết phân đoạn được các dược liệu trong các dung môi có độ phân cực khác nhau, mỗi dược liệu có 4 mẫu cắn phân đoạn trong các dung môi n-hexan, dicloromethan, ethylacetat và nước.
Đã sàng lọc hoạt tính chống ung thư của các mẫu cắn phân đoạn của 3 dược liệu. Cắn phân đoạn ethyl acetat Bán chi liên, cắn phân đoạn dicloromethan Bạch hoa xà thiệt thảo và cắn phân đoạn dicloromethan nấm Linh chi là ba phân đoạn cho hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh nhất. Đã xác định được chất đánh dấu scutellarin (bán chi liên), acid oleanolic (BHXTT) và acid ganoderic A (nấm Linh chi).

3.5.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế cao định chuẩn Bán chi liên

Chiết hồi lưu, dung môi chiết xuất là ethanol 70 %, tỉ lệ DM/DL là 12/1, thời gian chiết 1 giờ, số lần chiết 3 lần. Dịch chiết được cô về cao đặc có hàm ẩm khoảng 25% tá dược phối hợp là tinh bột, tỷ lệ phối hợp là 20% so với lượng chất rắn có trong cao, sấy khô ở nhiệt độ sấy 90oC trong 13-15 giờ.

3.5.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế cao định chuẩn Bạch hoa xà thiệt thảo

Chiết hồi lưu, dung môi chiết xuất là EtOH 96%, tỉ lệ DM/DL là 12/1, thời gian chiết 0,5 giờ, số lần chiết 2 lần. Khi đó, hiệu suất chiết acid oleanolic đạt trên 90%. Dịch chiết được cô về cao đặc có hàm ẩm khoảng 18%, tá dược phối hợp là tinh bột, tỷ lệ phối hợp là 40% so với lượng chất rắn có trong cao, sấy khô ở nhiệt độ sấy 90oC trong 18-22 giờ.

3.5.4. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế cao định chuẩn nấm Linh chi

Dược liệu đầu tiên được chiết hồi lưu, dung môi chiết xuất là ethanol 96 %, tỉ lệ DM/DL là 12/1, thời gian chiết 0,5 giờ/lần, số lần chiết 2 lần. Bã dược liệu được chiết hồi lưu, dung môi là nước, tỷ lệ DM/DL là 12/1, thời gian chiết là 2 giờ/lần, số lần chiết là 2 lần. 2 loại dịch chiết được cô về cao đặc có hàm ẩm khoảng 20 % sau đó được trộn đều. Tá dược phối hợp vào cao đặc là tinh bột, tỷ lệ phối hợp là 40% so với lượng chất rắn có trong cao, sấy khô ở nhiệt độ sấy 90oC trong 18-21 giờ.

3.6. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của 03 loại cao định chuẩn Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi

Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao định chuẩn Bán chi liên:
+ Tính chất: Khối bột khô tơi, đồng nhất, màu xanh nâu, dễ hút ẩm, có mùi thơm đặc trưng của dược liệu, không có mùi nấm mốc, vị đắng.
+ Mất khối lượng do làm khô: Không quá 5 %.
+ Độ mịn: Không ít hơn 90% bột qua rây số 355.
+ Định tính (+).
+ Định lượng: scutellarin không dưới 10,0 mg/g tính theo bột khô kiệt.
+ Tro toàn phần: Không quá 12,0 %.
+ Kim loại nặng: Pb ≤ 3,0 ppm; Cd ≤ 1,0 ppm; As ≤ 1,0 ppm; Hg ≤ 0,1 ppm.
+ Giới hạn nhiễm khuẩn: đạt yêu cầu theo Phụ lục 13.6, DĐVN V.
Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao định chuẩn Bạch hoa xà thiệt thảo:
+ Tính chất: Khối bột khô tơi, đồng nhất, màu xanh nâu, dễ hút ẩm, có mùi thơm đặc trưng của dược liệu, không có mùi nấm mốc, vị đắng.
+ Mất khối lượng do làm khô: Không quá 5 %.
+ Độ mịn: Không ít hơn 90% bột qua rây số 355.
+ Định tính (+).
+ Định lượng: Acid oleanolic không dưới 5 mg/g tính theo bột khô kiệt.
+ Tro toàn phần: Không quá 6,0 %.
+ Kim loại nặng: Pb ≤ 3,0 ppm; Cd ≤ 1,0 ppm; As ≤ 1,0 ppm; Hg ≤ 0,1 ppm.
+ Giới hạn nhiễm khuẩn: đạt yêu cầu theo Phụ lục 13.6, DĐVN V.
Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao định chuẩn nấm Linh chi:
+ Tính chất: Khối bột khô tơi, đồng nhất, màu nâu đỏ sẫm, dễ hút ẩm, có mùi thơm đặc trưng của dược liệu, không có mùi nấm mốc, vị đắng.
+ Mất khối lượng do làm khô: Không quá 5 %.
+ Độ mịn: Không ít hơn 90% bột qua rây số 355.
+ Định tính (+).
+ Định lượng: Hàm lượng AGA không dưới 12 mg/g tính theo bột khô kiệt.
+ Tro toàn phần: Không quá 7,0 %.
+ Kim loại nặng: Pb ≤ 3,0 ppm; Cd ≤ 1,0 ppm; As ≤ 1,0 ppm; Hg ≤ 0,1 ppm.
+ Giới hạn nhiễm khuẩn: đạt yêu cầu theo Phụ lục 13.6, DĐVN V.

3.7. Kết quả nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng Anti-U200

3.7.1. Kết quả nghiên cứu khảo sát tỷ lệ phối hợp 3 loại cao định chuẩn Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và nấm Linh chi trong công thức bào chế

Qua sàng lọc đánh giá các tác dụng dược lý, lựa chọn tỷ lệ phối hợp các thành phần như công thức HH1 (tỉ lệ bán chi liên: bạch hoa xà thiệt thảo: nấm linh chi là 3:3:1) làm tỷ lệ phối trộn trong công thức viên nang Anti – U200.

3.7.2. Kết quả xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng Anti – U200

Lựa chọn được biomarker trong hỗn hợp HH1 là hoạt chất scutellarin. Lựa chọn được công thức cho viên nang cứng Anti-U200 như sau: Cao bạch hoa xà thiệt thảo 210mg, cao bán chi liên 210mg, cao linh chi 70mg, MgCO3 15mg, dung dịch PVP K30 7% trong Ethanol 96% 0,021ml, Aerosil 13,76mg, Talc 6,24mg. Viên nang đạt độ rã với thời gian là 7 phút nhỏ. Hàm ẩm <3%. Khối lượng trung bình của viên không tính vỏ nang là 525 mg (RSD = 1.8%) chứa 490 mg bột HH1.
Quy trình được mô tả như sau: Cao khô bán chi liên, linh chi được nghiền và rây qua rây 0.25mm. Cao khô bạch hoa xà thiệt thảo được nghiền nhỏ cùng với MgCO3 sau đó cũng rây qua rây 0.25. Các khối bột được cân sao cho đảm bảo tỷ lệ các cao khô và đem trộn trong thời gian 25 phút. Chuyển khối bột kép sang máy nhào ẩm, thêm dung dịch PVP 7% trong cồn 96ºC, nhào trộn đều khối ẩm trong khoảng 6 phút. Khối bột ẩm được ủ và xát hạt qua rây 1mm để thu được cốm ướt. Cốm khô với hàm ẩm dưới 3% thu được từ cốm ướt bằng cách sấy tĩnh điện 55ºC. Cốm và tá dược trơn sử dụng đóng vào nang cứng số 0 với tổng khối lượng chưa kể vỏ nang là 525 mg.
Đã xây dựng được quy trình bào chế viên nang cứng 10.000 viên/mẻ.

3.8.Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của sản phẩm viên nang cứng Anti-U200

Tính chất: Bột thuốc trong viên nang có dạng bột khô tơi, màu xanh nâu sẫm, không có nấm mốc, mùi thơm đặc trưng của dược liệu, vị đắng, dễ hút ẩm ngoài không khí.
Mất khối lượng do làm khô: Không quá 9,0%.
Độ rã: Không quá 30 phút.
Độ đồng đều khối lượng: Khối lượng trung bình thuốc trong nang ± 7,5%.
Định tính: trên bản mỏng sắc ký của mẫu dịch chiết bột thuốc nang phải xuất hiện các vết chính có cùng Rf và màu sắc với các vết chính xuất hiện trên bản sắc ký của lần lượt từng mẫu dược liệu BCL chuẩn, BHXTT chuẩn và NLC chuẩn.
Định lượng: Hàm lượng scutellarin và acid ganoderic A của viên nang lần lượt không dưới 2,0 mg/viên và 0,8 mg/viên.
Tro không tan trong acid HCl: Không quá 2,0 %.
Kim loại nặng: Pb ≤ 3,0 ppm; Cd ≤ 1,0 ppm; Hg ≤ 0,1 ppm; As ≤ 1,0 ppm.
Giới hạn nhiễm khuẩn: đạt yêu cầu theo Phụ lục 13.6, DĐVN V.
Đã đánh giá được độ ổn định của viên nang cứng Anti-U200.

3.9. Kết quả đánh giá tính an toàn và tính hiệu quả trên thực nghiệm của sản phẩm viên nang cứng Anti-U200

3.9.1. Kết quả đánh giá tính an toàn của sản phẩm Anti-U200

Độc tính cấp: Vì không có chuột chết ở tất cả các lô nên chưa xác định được LD50 của viên nang cứng Anti-U200 trên chuột nhắt trắng theo đường uống.
Độc tính bán trường diễn: Anti-U200 liều 0,96 viên/kg/ngày và liều 2,88 viên/kg/ngày không gây ảnh hưởng tới tình trạng chung của chuột, không làm thay đổi các chỉ số về sự gia tăng trọng lượng cơ thể. Ở liều 0,96 viên/kg/ngày và liều 2,88 viên/kg/ngày cũng không làm thay đổi các chỉ số đánh giá chức năng tạo máu, chức năng gan, chức năng thận, đồng thời thuốc thử cũng không gây tổn thương cấu trúc của gan và thận trên các quan sát đại thể và vi thể.

3.9.2. Kết quả đánh giá tính hiệu quả của sản phẩm Anti-U200

Về tác dụng kích thích miễn dịch: Anti-U200 liều 1,92 viên/kg/ngày và liều 5,76 viên/kg/ngày uống liên tục trong 7 ngày thể hiện tác dụng kích thích miễn dịch trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY liều 200 mg/kg.
Tác dụng chống oxy hóa: Anti-U200 liều 5,76 viên/kg/ngày uống liên tục trong 10 ngày có thể có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol liều 400 mg/kg.
Về tác dụng chống ung thư: Anti-U200 liều 1,92 viên/kg/ngày và liều 5,76 viên/kg/ngày uống liên tục trong 14 tuần thể hiện tác dụng kháng u trên chuột nhắt trắng bị gây ung thư bằng DMBA liều 1 mg/tuần uống trong 6 tuần.

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Đã xây dựng quy trình kỹ thuật trồng, mô hình trồng, mô hình sơ chế chế biến Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo theo hướng GACP – WHO.
Đã xây dựng được TCCS cho các dược liệu Bán chi liên, bạch hoa xà thiệt thảo và nấm linh chi.
Đã xây dựng quy trình bào chế 03 cao định chuẩn Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thảo, và nấm Linh chi và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho 03 cao định chuẩn.
Đã xây dựng công thức, quy trình bào chế viên nang cứng Anti-U200 xà xây dựng tiêu chuân cơ sở, đánh giá độ ổn định của sản phẩm bào chế được.
Đã đánh giá tính an toàn và tính hiệu quả trên thực nghiệm của sản phẩm viên nang cứng Anti-U200.

4.2. Kiến nghị

Cần nghiên cứu ứng dụng khoa học hiện đại để nâng cao kỹ thuật sơ chế, chế biến và bảo quản dược liệu, tạo ra các sản phẩm chất lượng, an toàn.
Về bào chế sản phẩm, cần tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất ở quy mô lớn hơn, quy mô công nghiệp.
Tiếp tục đánh giá độ ổn định của sản phẩm trong điều kiện thường trong khoảng thời gian dài hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ môn ung thư, trường Đại học Y Hà Nội (2001) Bài giảng ung thư học. Nhà xuất bản Y học.
2. Nguyễn Bá Đức (2011), Ung thư học đại cương, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tr.10 – 30.
3. Sato Y, Suzaki S, Nishikawa T, et al (2000) Phytochemical flavones isolated from Scutellaria barbata andantibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus, J Ethnopharmacol, 72, pp. 483-488.
4. Sonoda M, Nishiyama T, Matsukwa Y (2004). Cytotoxic activities offlavonoids from two Scutellaria plants in Chinese medicine, J Ethnopharmcol, 91(1), pp. 65-68.
5. Yao H, Li SG, Hu J, et al (2011).Chromatographic Fingerprint and Quantitative Analysis of SevenBioactive Compounds of Scutellaria barbata. Planta Med, 77, 388
6. Yu JQ, Lei JC, Yu HD, Cai X, Zou GL (2004). Chemical composition andantimicrobial activity of the essential oil of Scutellaria barbata. Phytochemistry, 65, 881-884.
7. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Những cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
8. Lê Đình Sáng (2010), Sổ tay cây thuốc và vị thuốc Đông Y, Ebook Đại học Bách Khoa, tr. 58 – 59.
9. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản y học, tr. 1370
10. Rui Chen, Jingyu He, Xueli Tong et al (2016). The Hedyotis diffusa Willd. (Rubiaceae): A Reviewon Phytochemistry, Pharmacology, Quality Controland Pharmacokinetics, Molecules, 21, pp. 710
11. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Những cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
12. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
13. Ángel Trigos, Jorge Suárez Medellín (2011), Biologically active metabolites of the genus Ganoderma: Three decades of myco-chemistry research, Revista Mexicana de micología, 34, pp.63 – 83
14. Paterson R.R.M (2006), “Ganoderma – a therapeutic fungal biofactory”, Phytochemistry, 67, pp.1985 – 2001.

PGS.TS Hồ Bá Do